ENZYMY

Enzymy jsou makromolekulární biochemické látky vyskytující se ve všech živých organizmech. Skládají se z mnoha aminokyselin, jsou tedy bílkovinného charakteru. Plní funkci katalyzátorů biochemických reakcí organizmu při trávení, dělení buňek atd. Jsou však využívané i v praxi. V textu lze enzymy poznat podle jejich obvyklého zakončení příponou -áza (není to však pravidlo).

Aktivita enzymů je závislá na teplotě prostředí, pH, působení inhibitorů atd. Aktivita enzymů se měří v katalech (zkr. kat). Katal je definován jako látkové množství substrátu, které je daný enzym schopen přeměnit za sekundu v daných podmínkách. V praxi jsou častěji používané dekadické zlomky katalu jako je mikrokatal (ukat). V lékařské praxi se používá jendotka kat/l, resp. ukat/l a udává aktivitu enzymů v biologickém materiálu jako je krev a její deriváty, moč nebo sperma.

Druhy enzymů

• oxidoreduktázy (EC 1) - katalyzují oxidačně-redukční reakce
• transferázy (EC 2) - přenášejí funkční skupiny (např. -NH₂)
• hydrolázy (EC 3) - katalyzují hydrolýzu chem. vazeb
• lyázy (EC 4) - katalyzují štěpení chemických vazeb jiným způsobem než hydrolýzou nebo redoxní reakcí
• izomerázy (EC 5) - katalyzují izomerizační reakce
• ligázy (EC 6) - spojují dvě molekuly kovalentní vazbou

Enzymy v lékařství

Jaterní profil

Jaterní profil ("jaterní testy") je souhrn laboratorních biochemických vyšetření, které umožňuje lékařům pomocí specifických chemických látek v lidském těle, jako jsou enzymy, proteiny nebo metabolity, zjistit stav jater pacienta a odhalit i jejich choroby. Test se provádí z krevního séra z 5 ml plné krve, jenž je hodnocena v biochemickém analyzátoru.
Enzymy v testech jaterního profilu:
AST - aspartátaminotransferáza, katalyzuje přenos aminoskupiny z L-aspartátu na 2-oxoglutarát
ALT - alaninaminotransferáza, katalyzuje přenos aminoskupiny z L-alaninu na 2-oxoglutarát
GMT - gama-glutamyltransferáza, umožňuje přenos gama-glutamylu z glutathionu na aminokyseliny a umožňuje tajk jejich přenos přes buněčnou membránu
ALP - alkalická fosfatáza, působí v zásaditém prostředí a umožňuje defosforylaci
ACP - kyselá fosfatáza, působí štěpení kyseliny fosforečné, je aktivní v kyselém prostředí

Enzymy a genetika

Jak již bylo zmíněno, enzymy se účastní biochemických pochodů při dělení buněk, zde jsou popsány především reakce spojené s replikací DNA a využití těchto poznatků v praxi.
DNA fingerprinting a PCR
DNA fingerprinting je molekulárně biologická metoda identifikace osob využívaná v kriminalistice. Zde popsaná metoda RFLP (polymorfizmus délky restrikčních fragmentů) je založena na enzymatickém rozštěpení molekuly DNA na specifické úseky, jenž se vyskytují ve více variantách, tedy alelách. Alely restrikčních úseků se liší délkou, jenž je dána počtěm opakování tandemových repetic, tj. krátkou sekvencí několika nukleotidů (např. ACTG-ACTG). Zde hraje roli enzym restrikční endonukleáza. Ta je schopna rozpoznat tyto specifické úseky a oddělit je od kódující DNA.

Součástí DNA fingerprintingu je kvantifikace a amplifikace těchto sekvencí. To se děje speciální molekulárně biologickou technikou zvanou polymerázová řetězová reakce (dále jen PCR, zkr. pochází z anglického označení polymerase chain reaction). Tento soubor chemických reakcí je prováděn v přístroji zvaném thermocycler. Klíčovou chemickou látkou v PCR je další enzym, tentokrát DNA polymeráza umožňující syntézu vláken.
Průběh PCR
1. Denaturace
Dvouvlákno sekvence je vysokou teplotou "rozdvojeno", tzn. komplementární vlákna se od sebe oddělí.
2. Anelace
Teplota reakční směsi se sníží a přidají se primery. Jsou to krátké oligonukleotidy, jenž jsou komplementární po celé délce DNA. Díky nim je DNA polymeráza schopna zkopírovat pouze vybranou sekvenci.
3. Elongace
Do reakce je nyní přidána DNA polymeráza. Díky ní se volné nukleotidy připoutají k označeným sekvencím. V prvním kroku tedy vznikne dvojnásobek sekvencí.
Celý tento proces se mnohokrát opakuje, aby ve výsledném roztoku - amplifikátu - bylo co nejvíce fragmentů.

Posledním krokem DNA fingerprintingu je gelová elektroforéza. Tou lze oddělit jednotlivé alely restrikčních fragmentů. Elektroforéza probíhá účinkem stejnosměrného elektrického proudu, obvykle na agarózovém gelu. Čím delší úsek, tím pomaleji protéká gelem. Jelikož má DNA přirozeně záporný náboj, pohybuje se k anodě. Ozářením UV světlem jsou viditelné jednotlivé píky, každý z nich představuje právě alelu dané sekvence. Soubor píků se nazývá DNA profil a každý jej máme jedinečný.

Příklady některých enzymů (a jejich zařazení)
amyláza (EC 3) - je obsažena ve slinách a pankreatické šťávě, hydrolytickou reakcí štěpí polysacharidy na molekuly maltózy
restrikční endonukleáza (EC 3) - štěpí molekuly DNA na restrikční fragmenty
DNA / RNA polymeráza (EC 2) - katalyzují syntézu vláken DNA / RNA, přenášejí volné nukleotidy a připojují je k řetězci
pepsin (EC 3) - štěpí molekuly bílkovin na oligopeptidy s nízkou molekulovou hmotností; nejvyšší aktivitu má v silně kyselém prostředí (pH je zvyšováno HCl)
trypsin (EC 3) - katalyzuje rozklad bílkovin ve dvanáctníku, nejvyšší aktivita trypsinu je v mírně alkalickém prostředí
alkoholdehydrogenáza (EC 1) - katalyzuje přeměnu primárních a sekundárních alkoholů na jim odpovídající karbonylové sloučeniny
lipáza (EC 3) - štěpí molekuly lipidů na glycerol a mastné kyseliny
topoizomeráza (EC 5) - umožňuje rozmotání dvoušroubovice DNA při replikaci, vzniká tak rovné, "nesešroubované" dvouvlákno
helikáza (EC 3) - rozplétá molekulu DNA na dvě dílčí vlákna